Ben Stiller está de volta acompanhado por um elenco de astros nesta hilária sequencia do filme que tanto sucesso fez com toda a família. Larry Daley (Stiller), o ex-guarda noturno do Museu de História Natural, agora e um sucesso empresarial. Mas, logo depois de ficar sabendo que seus amigos do museu foram enviados para o Museu Smithsonian, Larry recebe um telefonema desesperado de Jedediah (Owen Wilson), avisando que quatro dos maiores vilões da história voltaram à vida e planejam tomar o Smithsonian, e depois o mundo. Larry se junta a velhos e novos amigos para deter os planos diabólicos.